Biomineralization in Magnetospirillum magnetotacticum

金沢大学Scedule:17-18 March 2003, Vemue: Kanazawa, Japan, Kanazawa Citymonde Hotel, Project Leader : Hayakawa, Kazuichi, Symposium Secretariat: XO kamata, Naoto, Edited by:Kamata, Naoto

Purification and characterization of a [3Fe-4S] [4Fe-4S] type ferredoxin from hyperthermophilic archaeon, Pyrobaculum islandicum

金沢大学理工研究域自然システム学系A ferredoxin was purfied from the hyperthermophilic archaeon, Pyrobaculum islandicum. EPR spectra and metal content analyses suggested that the ferredoxin molecule contained one [3Fe-4S] and one [4Fe-4S] cluster. The ferredoxin was rapidly reduced by 8-oxoglutarate: ferredoxin oxidoreductase purfied from P. islandicum, indicating that it functions physiologically as an electron sink for the redox enzymes participating in glycolytic metabolism. Furthermore, the amino acid sequence of the P. islandicum ferredoxin was compared with those of several other bacterial ferredoxins

磁性細菌のGタンパク質融合型鉄輸送体: 精製と再構成

金沢大学理工研究域1.N-FeoBの大量発現と抗N-FeoB抗体の作製FeoBを精製するには、高感度なアッセイ系が必要である。そこで、本年度は、抗-FeoB抗体を作製した。具体的には,FeoBのN末端ドメイン(245アミノ酸残基)をコードするDNA断片をPCRで増幅、PCRエラーが無いことを確認し、pET-15b vectorにクローニングした。大量発現には大腸菌BL12株を用いた。N-FeoBは封入体として発現しており、大腸菌より封入体を調製し、変性条件下でNiアフィニティクロマトグラフィにより精製した。大量発現の結果得られたN-FeoBをトロンビンで処理しHis-tag部分を取り除き、SDS-PAGEしたゲルから切り出すことで、更に精製した。得られた精製標品を抗原としてウサギに免疫した。抗体価は二重免疫拡散法とドットブロット法により測定し、アッセイに十分な抗体価をもつ抗血清が得られた。2.磁性細菌M.magnetotacticumの大量培養と膜画分の調製M.magnetotacticumを120Lの合成培地で培養し、25gの細胞を得た。細胞をフレンチプレスで破砕し遠心分離(8,000xg)によって未破砕細胞とマグネトソームを取り除き、更に、超遠心(100,600xg)し沈澱を回収することで膜画分(細胞膜と外膜を含む)を調製した。3.FeoBの検出抗N-FeoB抗体を用いてWestern blotを行い、M.magnetotacticumの膜画分からFeoBの検出を行った。その結果、73.6kDaのメジャーなバンドと2つのマイナーバンド(81.5,61.1kDa)が確認できた。メジャーなバンドの分子量はfeoB遺伝子の塩基配列から推定される分子サイズとほぼ一致した。このことから本細菌のFeoBは膜画分に存在していることが明らかになった。4.FeoBの精製(可溶化条件の検討)FeoBの精製を行う為、膜可溶化条件を検討した。可溶化効率はWestern blotによって検出したバンドをルミノイメージアナライザーによって定量し、求めた。その結果、デオキシコール酸ナトリウムが最も効率的にFeoBを可溶化できることが分かった。現在,アフィニティ、イオン交換、ゲルろ過、ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィによりFeoBの精製を試みている。研究課題/領域番号:16048211, 研究期間(年度):2004出典：「磁性細菌のGタンパク質融合型鉄輸送体: 精製と再構成」研究成果報告書　課題番号16048211（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16048211/)を加工して作

巨大ヘモグロビン複合体の構造生物学

金沢大学理工研究域能登半島九十九湾の水深25m付近に生息する無脊椎動物Oligobrachia mashikoiは口も消化管も無く、共生する細菌が化学合成する有機物を利用してエネルギーを獲得する有鬚動物である。宿主のヘモグロビンは細胞外に存在し、分子量が約45万と巨大であり、酸素だけでなく共生細菌に硫化水素を運搬するという特徴ある機能を有している。本研究では巨大ヘモグロビン複合体の結晶化と立体構造の解明により超分子複合体形成の生物学的意義を解明することを目的に、本タンパク質の結晶化とX線結晶構造解析を試みた。その結果、(1)Oligobrachia mashikoi巨大ヘモグロビンの結晶を得るために様々な条件でハンギングドロップ法を用いて結晶化に取り組み、前年度より大きな結晶を得ることに成功した。(2)京都大学理学部三木邦夫教授との共同研究により、同結晶をガラスキャピラリに封入し、室温でのX線回折実験を行った。その結果、最大で4Å前後の回折像が観測された。しかしながら、室温での測定でもありX線による損傷のため、フルデータを収集するには至らなかった。一方、鹿児島湾に生息する有髭動物Lamellibrachia satsumaはOligobrachia mashikoiと異なり、分子量45万と400万の2種類のヘモグロビンを持つ。本研究では、両ヘモグロビンの結晶化を試みたが、分子量45万ヘモグロビンの結晶は得られなかった。一方、分子量400万のヘモグロビンに関しては良好な結晶が得られた。しかしながら、この結晶は温度感受性が高く、また、分子量400万としては、その大きさが微小な為に未だにX線回折像は得られていない。研究課題/領域番号:13033014, 研究期間(年度):2001-2002出典：「巨大ヘモグロビン複合体の構造生物学」研究成果報告書　課題番号13033014（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13033014/)を加工して作

NO還元酵素の構造解析と機能変換

金沢大学理工研究域本研究では、これまで多くの研究者により脱窒機構解明のモデル生物として研究されてきたPseudomonas aeruginosaからcb型NO還元酵素を精製し、その酵素的性質を明かにすることを試みた。グルタミン酸を炭素源とする合成培地で嫌気条件下に培養した菌体を超音波破砕し、細胞質膜を高度に精製した。NO還元酵素を可溶化するために種々の界面活性剤を検討したところ、TritonX-100でも本酵素のNO還元酵素活性を保持したまま可溶化できることを見い出したので、本酵素の精製はすべてTritonX-100存在下に行った。NO還元酵素を1%TritonX-100で可溶化後、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過により精製を試みた。その結果、湿重量100gの菌体から電気泳動的均一な酵素標品を約19mg得ることに成功した。本酵素は、heme b/heme c/非ヘム鉄を含むcb型酵素であり、2種類のサブユニットから構成されていた。本酵素がNO以外にO_2を還元するか検討したところ、ウマチトクロムcを電子供与体にしてO_2を4電子還元し、さらにそのKi(KCN)は約1mMであった。本研究によりcb型NO還元酵素が一般的に酸素還元能を持つことが強く示唆され、「cb型NO還元酵素の複核金属中心にはもともと酸素還元能が備わっており、非ヘム鉄から銅へ置換は本酵素の酸素に対する親和性を増す結果となり、そのことにより低濃度の酸素環境下でも機能できる酸素還元酵素が生じた。」とする新しい仮説が提案された。研究課題/領域番号:10129208, 研究期間(年度):1998出典：「NO還元酵素の構造解析と機能変換」研究成果報告書　課題番号10129208（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10129208/)を加工して作

Identification of iron transporters expressed in the magnetotactic bacterium magnetospirillum magnetotacticum

金沢大学理工研究域自然システム学系The magnetotactic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum MS-1 mineralizes the magnetite (Fe3O4) crystal and organizes a highly ordered intracellular structure, called the magnetosome. However, the iron transport system, which supports the biogenesis of magnetite, is not fully understood. In this study, we first identified the expressions of both the ferric and the ferrous iron transporter proteins in M. magnetotacticum. The cellular protein compositions of ferric and ferrous iron-rich cultures were examined using two-dimensional electrophoresis. According to the gel patterns, two outer-membrane ferric-siderophore receptor homologues were identified as proteins strongly induced in the ferrous iron-rich condition. Also, we identified for the first time that the ferrous iron transport protein, FeoB, is expressed in the M. magnetotacticum cytoplasmic membrane using immunoblotting.

アンモニア酸化細菌のマルチヘム蛋白質の構造生物学

(1)チトクロムc-554とチトクロムc-552のX線結晶構造解析 一般に、蛋白質の立体構造の解明は、その分子量でなく結晶の性質に依存する。私たちが解明したヒドロキシルアミン酸化還元酵素の分子量は約210,000であるが、分子量約26,000のチトクロムc-554と分子量約12,000のチトクロムc-552については結晶が得られているのみで、分子構造は明らかとなっていない。そこで、本年度は両チトクロムcの結晶化を検討した。その結果、チトクロムc-552についてはアモルファス沈澱を得ることができたが、チトクロムc-554については、全く結晶を得ることができなかった。 (2)マルチヘム蛋白質分子内及び分子間電子伝達機構の解明 ヒドロキシルアミン酸化還元酵素の反応機構に関してはヒドロキシルアミンが“NOH"を中間体として、亜硝酸に酸化されるモデルが一般に受け入れられている。すなわち、2回の2電子酸化反応が酵素分子内で迅速に進行することがきわめて重要であると考えられる。しかしながら、酵素分子に含まれる電子伝達成分は全てヘムであり、1電子伝達体である。一方、その電子受容体であるチトクロムc-554もヘムcを4分子持つマルチヘム蛋白質である。本年度は、立体構造の情報に基づきヒドロキシルアミン酸化還元酵素の電子伝達機構を明らかにすることを試みた。その結果、酵素1分子内にある8個のヘムは、ヘムクラスターを形成しており、3ヘムクラスターが1個、2ヘムクラスターが2個および1ヘムが1個という形で分子内に分布していた。とくに、3ヘムクラスター内の1つのヘムは基質結合部位であることから、分子内では3ヘムクラスター→2ヘムクラスター→2ヘムクラスターの2電子伝達がすみやかに進行するヘム配置が保持されていることが明らかになった。(1)Crystalographic studies on cytochrome c-554 and cytochrome c-552.We investigated the conditions for cyrstallization of cytochrome c-554 and c-552. Although the amorphous precipitates were obtained from cytochrome c-552 preparation, no crystals could not be prepared from cytochrome c-554.(2)Mechanism of intra- and inter-electron transfers in the multi-heme protein.It is generally accepted that the "NOH" is produced as an intermediate in the oxidation of hydroxylamine to nitrite by the hydroxylamine oxidoreductase. This strongly suggest that the two steps of two-electron transfer in the molecule is precisely occurred. However, the hydroxylamine oxidoreductase has only hemes c as prosthetic groups in the molecule which is one electron transfer component. In 1998, we tried to elucidate the molecular mechanism of electron transfer in the hydroxylamine oxidoreductase on the basis of the crystal structure. We found that the enzyme is a trimer and each monomer has 8 hemes c in the molecule, indicating that the enzyme has totally 24 hemes c in the molecule. The hemes are aligned to form a ring as heme-cluster in the molecule. One is triple heme-cluster which is composed to be a substrate-binding heme c, P460, and two hemes c. Another is double heme-cluster. The monomer has one triple-heme cluster, two double heme-clusters and one heme c in the molecule, suggesting that the electron transfer is triple-heme cluster * double heme-cluster * double heme-cluster. The characteristic heme arrangement has been elucidated in the present study.研究課題/領域番号:09660076, 研究期間(年度):1997–1998出典：「アンモニア酸化細菌のマルチヘム蛋白質の構造生物学」研究成果報告書　課題番号09660076 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

Structural analyses of the deduced amino acid sequences of a novel type heme-copper terminal oxidase, cytochrome aco3, from alkalophilic Bacillus YN-2000

金沢大学大学院自然科学研究科動態生理学Cytochrome aco3 from a facultatively alkalophilic bacterium, Bacillus YN-2000, was found to be alkaline- and heat-tolerant. To better understand the structural features of Bacillus YN-2000 cytochrome aco3, the gene encoding this enzyme was cloned and sequenced. Nucleotide sequence analyses of the region neighboring the acoI (subunit I) gene revealed that the acoII (subunit II) and acoIII (subunit III) genes were concomitantly clustered upstream and downstream of the acoI gene, respectively, forming an operon with transcriptional polarity. The deduced amino acid sequence of subunit I was highly similar to that of cytochrome caa3 from thermophilic bacterium Bacillus PS3 in which the heme a3 could be replaced with heme o. Furthermore, a marked paucity of basic amino acid residues was found in the cytochrome c-binding subunit II, which might be a result of the adaptation to a highly alkaline external milieu